摘要:
目的通过建立酵母单杂交文库筛选出与毛白杨特异性调控元件结合的候选蛋白,为研究毛白杨木材合成相关基因奠定基础.方法采用模板基因PCR方法,分别将ABRE-box、AC-box及-317-Box三次重复序列连接至pAbAi诱饵质粒上,再将诱饵载体转入酵母中;使用磁珠法获得mRNA,采用SMART技术合成cDNA,以cDNA为模板进行LD-PCR并将产物纯化后与pGADT7-Rec载体共转化诱饵酵母,同时进行文库的构建与筛选.结果以pBI121质粒为模板扩增获得的ABRE/AC/-317-GUS片段约为650 bp.以Kpn I对重组质粒pAbAi-ABRE/AC/-317-GUS进行单酶切,获得约5000 bp的大片段与650 bp的小片段;测序结果表明,插入序列与ABRE/AC/-317序列一致且方向正确.在SD/Ura培养基中,当AbA为100 ng/mL时,酵母菌落数为0,建库时AbA为100 ng/mL.cDNA与pGADT7载体共转化的酵母Y 1HGold(pAC-AbAi)细胞稀释100倍后,在SD/-Leu培养基上长出89个克隆,含AC-box的诱饵酵母所建库容量为1.3×106,且无rRNA污染.酵母转化产物在SD/-Leu/AbA(100 ng/mL)培养基上长出18个克隆,大于250 bp的有13个克隆;测序和同源分析结果表明,成功筛选到5个候选蛋白,主要是蛋白激酶、核小体蛋白及功能未知蛋白,这些蛋白可作为与AC元件结合的候选蛋白.结论建立的毛白杨酵母单杂体系可用于进一步筛选与木材合成相关的基因.
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