张晓溪, 刘庆友, 邓彦飞, 罗婵, 崔奎青, 石德顺. 2014: 水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定. 南方农业学报, 45(5): 858-863. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.5.858
引用本文: 张晓溪, 刘庆友, 邓彦飞, 罗婵, 崔奎青, 石德顺. 2014: 水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定. 南方农业学报, 45(5): 858-863. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.5.858
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ZHANG Xiao-xi, LIU Qing-you, DENG Yan-fei, LUO Chan, CUI Kui-qing, SHI De-shun. 2014: Cloning and identification of buffalo RNA polymerase Ⅲ promoters. Journal of Southern Agriculture, 45(5): 858-863. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.5.858
Citation: ZHANG Xiao-xi, LIU Qing-you, DENG Yan-fei, LUO Chan, CUI Kui-qing, SHI De-shun. 2014: Cloning and identification of buffalo RNA polymerase Ⅲ promoters. Journal of Southern Agriculture, 45(5): 858-863. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.5.858
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水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

Cloning and identification of buffalo RNA polymerase Ⅲ promoters

    摘要
  • 摘要: 目的获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.方法通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.结果克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05).结论水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.

     

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