何正贵, 尹燕辰, 毛佑志, 周思行, 潘琪, 魏东芝, 高蓓. 2014: 微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达. 南方农业学报, 45(2): 165-172. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.2.165
引用本文: 何正贵, 尹燕辰, 毛佑志, 周思行, 潘琪, 魏东芝, 高蓓. 2014: 微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达. 南方农业学报, 45(2): 165-172. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.2.165
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HE Zheng-gui, YIN Yan-chen, MAO You-zhi, ZHOU Si-xing, PAN Qi, WEI Dong-zhi, GAO Bei. 2014: Cloning and high-level expression of thermostable α-amylase gene from Rhizomucor pusillus. Journal of Southern Agriculture, 45(2): 165-172. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.2.165
Citation: HE Zheng-gui, YIN Yan-chen, MAO You-zhi, ZHOU Si-xing, PAN Qi, WEI Dong-zhi, GAO Bei. 2014: Cloning and high-level expression of thermostable α-amylase gene from Rhizomucor pusillus. Journal of Southern Agriculture, 45(2): 165-172. DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.2.165
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微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达

Cloning and high-level expression of thermostable α-amylase gene from Rhizomucor pusillus

    摘要
  • 摘要: 目的开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力.方法采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy.以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因(RpAmy)转入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物.结果克隆得到嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高(56.0%).RpAmy在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性(4.0~9.0)和较高的温度耐受性(60℃);水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖(69.0%,w/w)和葡萄糖(22.0%,w/w).结论从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆得到α-淀粉酶基因(RpAmy),其可在毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy.该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力.

     

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