摘要: 目的构建用于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)pyrR基因敲除的温敏型敲除载体,为研究pyrR蛋白缺失对胞苷合成的影响奠定基础.方法设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用PCR分别扩增pyrR基因的上游同源序列和下游同源序列,再定向克隆至含卡那抗性基因的pKS1温敏型载体上,构建敲除载体pKS 1-pyrR.结果经特异性引物对pyrR-S 1/pyrR-A1和pyrR-S2/pyrR-A2扩增,获得解淀粉芽孢杆菌目的DNA片段pyrR-up和pyrR-down,大小约500 bp;目的片段经克隆载体pMD 19-T连接、Trans 1-T1转化,获得的重组质粒分别以Kpn Ⅰ/Hind Ⅲ、Pst Ⅰ/NotⅠ双酶切鉴定和测序后,可获得大小约500 bp的上、下游克隆载体T-pyrR-up和T-pyrR-down.上游克隆载体T-pyrR-up经Kpn Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切及T4 DNA连接、Trans1-T1转化后,进行重组载体检测和质粒双酶切鉴定,得到大小分别为433、5064 bp的片段,与连接长度一致,构建获得带标记基因的重组载体pKS 1-pyrR-up.采用PstⅠ和NotⅠ对T-pyrR-down和pKS 1-pyrR-up同时进行双酶切,经连接、转化、双酶切鉴定后,得到两条长度分别为446和5497 bp的片段,与连接前长度一致,证明pyrR的上、下游同源臂已正确插入到pKS1载体中,获得敲除载体pKS 1-pyrR.结论构建的解淀粉芽孢杆菌pyrR基因敲除载体pKS1-pyrR可用于研究敲除pyrR基因及pyrR蛋白缺失对胞苷过量合成的影响.