摘要: 目的建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持.方法以广西割手密GXS87-16、GXS85-30、GXS79-9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如MG2+、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化.结果样品DNA用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各3U于PCR仪过夜可完全酶切.经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0.4 μL dNTPs(20 mmol/mL),1.6 μL Mg2+(25mmol/mL),2.0 μL EcoR Ⅰ-P(5 pmol/mL),2.0μL Mse Ⅰ-P(5 pmol/mL),1 UTaq酶(1 U/μL),DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0.4 μL dNTPs(20 mmol/mL),0.8 μL Mg2+(25 mmol/mL),1.0 μL EcoR Ⅰ-AAG(6 pmol/mL),1.0μL Mse Ⅰ-CAG(6 pmol/mL),3U Taq酶(1 U/μL),DNA模板稀释20倍.以对优化反应体系扩增获得的PCR产物用5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱.结论建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持.