摘要: 目的建立高效制备咖啡炭疽菌原生质体及聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化体系的方法,为开展咖啡炭疽菌的致病分子机理研究打下基础.方法以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2为试验材料,通过PEG介导原生质体转化法将含有氯嘧磺隆标记和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的质粒pCB1532-G转入BSC2-2原生质体中,对获得的转化子进行遗传稳定检测、PCR分子检测和激光共聚焦显微观察.结果BSC2-2对氯嘧磺隆的耐受浓度为200.0 mg/L.最佳遗传转化体系为:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌丝2 h,收集原生质体,再经MTC缓冲液冲洗重悬后将质粒pCB1532-G转入原生质体,在RM培养基中混匀再生,获得转化子.GFP基因的PCR扩增和分生孢子荧光观察结果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中.转化子与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病力上无明显差别,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中稳定遗传.结论成功建立了PEG介导的咖啡炭疽菌遗传转化体系,获得与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病性上无明显差别的转化子,为后续研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病机理提供技术支持.