摘要: 目的解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持.方法根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodonTM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPAG6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测.结果优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基.将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPAG6重组载体,经EcoR I和Hind III双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp),测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致.proEM-bPAG6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD.重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性.重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成.结论通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发.