摘要: 目的明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据.方法通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白进行分子特征分析;构建原核表达载体pET-CatB4,经IPTG诱导获得融合蛋白后进行SDS-PAGE和Western blotting检测分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制备多克隆抗体,利用免疫组化对融合蛋白在肝片吸虫体内的表达进行定位分析.结果肝片吸虫CatB4基因片段为699 bp,其编码蛋白等电点(pI)7.95,理论分子质量25.89 kD,无信号肽和跨膜区,属于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点,有9个抗原决定簇,具有高度保守的CatB结构域,是由无规则卷曲连接9个α-螺旋和8个β-折叠构成其空间结构.基于CatB4基因核苷酸序列同源性构建的系统发育进化树显示,肝片吸虫和大片吸虫聚为一支,二者的同源性为83.98%.SDS-PAGE检测和Western blotting分析结果均显示在41.80 kD处能检测到目的条带.以纯化融合蛋白CatB4与弗氏佐剂乳化后免疫的小鼠均可产生特异性抗体,证实融合蛋白CatB4具有较强的免疫原性;免疫组化定位分析结果显示,在肝片吸虫的卵黄腺腺体细胞、排泄管上皮细胞、肠道上皮细胞和卵黄腺管上皮细胞均发生特异性的抗原抗体反应,呈深棕色.结论诱导表达获得的融合蛋白CatB4可特异性识别绵羊肝片吸虫阳性血清,具有较强的免疫原性,且主要在肝片吸虫分泌排泄组织器官中表达,说明CatB4蛋白具有作为肝片吸虫候选抗原的潜力.