牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

Development of SYBR GREEN Ⅰ real-time PCR method for detecting Mycobacterium bovis

摘要: 目的建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持.方法根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验.结果牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109~1.0x10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48~86.65C.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致.结论建立的SYBR Grccn Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断.